自20世紀(jì)40年代起，人們都采用兔眼Draize試驗(yàn)評(píng)判化妝品原料及其成品的眼刺激。但動(dòng)物試驗(yàn)在化妝品企業(yè)中開(kāi)展難度、成本等相對(duì)較高，因此動(dòng)物替代方法成為了企業(yè)內(nèi)部的首選。

測(cè)試類型可分為四類，包括細(xì)胞（如3T3成纖維細(xì)胞，人原代角質(zhì)形成細(xì)胞等）、離體器官（如牛角膜、豬角膜、兔眼球、雞眼球等）、類器官（如雞胚等）、人工組織方法（如重建角膜Epiocular、3D表皮模型等）。其中絨毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）取樣方便、容易，中胚層富含的血管網(wǎng)絡(luò)很好地模擬了眼結(jié)膜結(jié)構(gòu)，因此，是眼刺激性試驗(yàn)替代方法中廣泛使用的模型之一。

目前使用CAM用于眼刺激測(cè)試的方法有三種：雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)（Hen’s egg test on the chorioallantoic membrane,HET-CAM）,雞胚絨毛尿囊膜血管試驗(yàn)（Chorioallantoic membrane vascular assay, CAMVA）,雞胚尿囊膜臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)(the chorioallantoic membrane-trypan blue staining assay, TBS-CAM)。本文將針對(duì)以上三種動(dòng)物替代試驗(yàn)展開(kāi)介紹。

1. 雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)（HET-CAM）

HET-CAM最早于1985年由Luepke建立，隨后國(guó)內(nèi)外對(duì)于HET-CAM的研究及應(yīng)用比較廣泛，2009年中國(guó)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局對(duì)于HET-CAM發(fā)布了檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN／T2329-2009，規(guī)范了HET-CAM的操作及評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。由于化學(xué)物對(duì)CAM的刺激反應(yīng)多種多樣，因此HET-CAM以出血、血管溶解、凝血作為觀察終點(diǎn)，即在雞胚發(fā)育第9天時(shí)神經(jīng)組織和痛感還沒(méi)形成的階段，檢測(cè)受試物導(dǎo)致CAM產(chǎn)生三種反應(yīng)的嚴(yán)重程度。針對(duì)不同狀態(tài)及劑型的化妝品或原料有不同的評(píng)價(jià)方法，對(duì)于透明液體受試物應(yīng)采用反應(yīng)時(shí)間法，記錄反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)三種反應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，從而計(jì)算樣品的刺激性。對(duì)于膏體或混濁液體則采用終點(diǎn)評(píng)價(jià)法，在反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)對(duì)反應(yīng)現(xiàn)象進(jìn)行評(píng)價(jià)。反應(yīng)時(shí)間法更強(qiáng)調(diào)的是血管效應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間快慢，與樣品最終造成的血管效應(yīng)嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。終點(diǎn)評(píng)價(jià)法則更強(qiáng)調(diào)的是最終產(chǎn)生的的嚴(yán)重程度，過(guò)程中對(duì)血管效應(yīng)產(chǎn)生的快慢無(wú)關(guān)。雖然在標(biāo)準(zhǔn)中記載的兩種方法是針對(duì)不同劑型的方法處理，但建議篩選和比對(duì)配方、原料時(shí)，最好是采用同一種處理方法進(jìn)行測(cè)試，對(duì)比性和參考性更強(qiáng)。

研究發(fā)現(xiàn)，HET-CAM可較好地檢測(cè)表面活性劑以及以表面活性劑為基礎(chǔ)的產(chǎn)品的刺激性，對(duì)于一些能對(duì)CAM進(jìn)行著色的物質(zhì)，HET-CAM不適用，且實(shí)驗(yàn)存在一定的主觀性，實(shí)驗(yàn)員在操作時(shí)，應(yīng)對(duì)血管現(xiàn)象了解、熟悉，避免出現(xiàn)誤判。

2. 雞胚尿囊膜臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)(TBS-CAM)

在HET-CAM的基礎(chǔ)上通過(guò)添加臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行改進(jìn)，可克服HET-CAM實(shí)驗(yàn)主觀性強(qiáng)和損傷難量化的缺點(diǎn)。

臺(tái)盼藍(lán)是一種廣泛用于區(qū)分存活細(xì)胞與死亡細(xì)胞的染料，常用于檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞的存活率。喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色而正常的活細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，細(xì)胞不會(huì)被染成藍(lán)色。TBS-CAM正是利用臺(tái)盼藍(lán)的這個(gè)特點(diǎn)，通過(guò)受試物與CAM接觸后，損傷的CAM會(huì)吸收加入的臺(tái)盼藍(lán)，一定時(shí)間后剪下CAM，沖洗、干燥并稱重，萃取后測(cè)量其萃取液吸光度值，通過(guò)計(jì)算單位膜重量吸收的臺(tái)盼藍(lán)的量（ISTB）作為檢測(cè)終點(diǎn)，以此用來(lái)評(píng)判受試物的刺激性。TBS-CAM不受劑型的束縛，即染色原料或化妝品不影響檢測(cè)結(jié)果的觀察，解決了HET-CAM不能用于染色物質(zhì)的測(cè)試的難題，亦能對(duì)損傷程度進(jìn)行量化，減少人為地對(duì)刺激性進(jìn)行評(píng)分，客觀地對(duì)刺激進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3. 雞胚絨毛尿囊膜血管試驗(yàn)（CAMVA）

CAMVA采用的是孵化至第10天的雞胚，將化妝品原液或特定濃度下的化妝品原料滴加于聚四氟乙烯樹(shù)脂環(huán)內(nèi)，培養(yǎng)30min后觀察環(huán)內(nèi)血管效應(yīng)-鬼影血管、充血以及不同程度出血并予以評(píng)分，最終計(jì)算其算術(shù)平均值即得到NC值。NC值則可以評(píng)判物質(zhì)在某個(gè)特定濃度下的刺激性。CAMVA適用于評(píng)價(jià)化妝品或一定濃度下的原料的刺激性，與使用濃度相關(guān)，可測(cè)得不同濃度下物質(zhì)的刺激性。與HET-CAM的終點(diǎn)評(píng)價(jià)法的共同點(diǎn)則是在于，CAMVA更強(qiáng)調(diào)的是通過(guò)樣品致CAM最終的損傷嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

綜上所述，三種試驗(yàn)各有其優(yōu)缺點(diǎn)（見(jiàn)表1），各在不同維度對(duì)刺激性進(jìn)行評(píng)價(jià)，在化妝品配方及原料篩選時(shí)，可選用一種或者組合的形式對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，如HET-CAM與TBS-CAM試驗(yàn)的結(jié)合，可從血管效應(yīng)產(chǎn)生的快慢以及對(duì)實(shí)驗(yàn)損傷程度的量化兩個(gè)維度對(duì)受試物進(jìn)行評(píng)價(jià)，也結(jié)合了主觀與客觀的評(píng)價(jià)，減少誤差。

表1

這類試驗(yàn)材料方便易得，操作相對(duì)簡(jiǎn)單易行，設(shè)備及耗材成本相對(duì)較低，結(jié)果易于觀察，在日化企業(yè)中搭建可行性較強(qiáng)。早期被美國(guó)機(jī)構(gòu)替代方法管理小組，歐洲委員會(huì)，英國(guó)內(nèi)務(wù)府，歐洲化妝品、盥洗用品和香水協(xié)會(huì)及日本、德國(guó)等廣泛研究與評(píng)價(jià)。

在中國(guó)，這方面的研究也有一定的進(jìn)展，報(bào)道顯示此方法是比較有前途的替代方法。隨著化妝品行業(yè)及消費(fèi)者的安全性意識(shí)的提高，以及替代試驗(yàn)的研究及技術(shù)的越來(lái)越成熟，包括基于CAM開(kāi)展的試驗(yàn)方法應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

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